在許多蛋白研究領域中,生物素標記肽通常與親和素結(jié)合而被檢測或純化: 免疫印跡(WB)、ELISA、免疫沉淀 (IP)、
多肽親和純化、免疫組化 (IHC)、細胞表面標記、流式細胞術(shù)/熒光激活細胞分類(FACS)。
合生生物提供生物素標記肽合成服務。通常,生物素可被標記在N端或C端(經(jīng)由Lys)。我們推薦N端標記,其標記的成
功率更高,所需時間更短,操作更簡潔。
生物素可通過各種不同的linker或spacers與多肽隔離。一般建議引入間隔器如Ahx(一個6碳鏈接器)讓生物素更穩(wěn)定
或更靈活。
合生生物提供N端或C端生物素標記:Biotin (N terminus), Lys(Biotin)(middle), Lys(Biotin)(C terminus)。
帶有linker(Ahx)的生物素化: Biotin-Ahx (N terminus), Lys(Ahx-Biotin)(middle), Lys(Ahx-Biotin)(C terminus)。
生物素標記肽的Pull-down實驗方案分析
生物素標記肽可與親和素磁珠共軛以生成樹脂,用于肽pulldown試驗。先把生物素標記肽上樣至Immobilized
streptavidin beads (Pierce) 錨定有親和素的磁珠上,再與細胞裂解液孵育。細胞裂解于1%(v/v)Nonidet P-40,
150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, protease inhibitors (Complete Tablets, Roche Applied
Science), 加入 1 mM sodium orthovanadate作為磷酸酶抑制劑。等量的蛋白質(zhì)分別與被錨定的多肽在4℃孵育6
小時。經(jīng)過大量洗滌,在SDS樣品buffer中煮沸,結(jié)合蛋白可從被錨定的多肽洗脫下來,或者,用50 mM
dithiothreitol將多肽與蛋白復合物從磁珠中斷開。將來自活性肽和對照目標肽pull-downs的洗脫液合并,以作進一
步的分析。