反應五要素:
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
產品名稱 | 節狀古柏線蟲PCR檢測試劑盒供應商 |
英文名稱 | Cooperia oncophoraPCR |
分類 | PCR檢測試劑盒 |
特點:
高特異性:與其他病毒無交叉反應,無非特異性擴增;
高靈敏度:檢測靈敏度可達10~100;
操作簡便:該系列所有試劑均采用相同的體系和條件,可同時進行多個檢測;
高通量:多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。
樣品 DNA 的制備:
1.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀釋陽性對照(以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 片段作為陽性對照。
2.標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭,在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中,得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。8.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。?
使用及效果:
PCR反應特點
(1) 特異性強
PCR反應的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結合;
②堿基配對原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中zui小檢出率為3個細菌。
(3) 簡便、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2~4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4) 對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活PCR技術概論。
Latexin/Lxn抗體(PE),兔單抗5mgFCM 芹菜素-7-葡萄糖苷 APIGENIN-7-O-GLUCOSIDE (COSMOSIIN)(P)
傳染性胸膜肺炎(APP)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)24502-79-2 20mgβ,β-Dimethylacrylshikonin HPLC≥98% 0.312-20 ng/mLβ,β-二基丙酰紫草素
IL-1R2/CD121b抗體,鼠單抗 95-13-6 100mg 0.991ELISA 茚
人酪蛋白激酶II亞基α(CKIIalpha)ELISA試劑盒2469-34-3 20mg/支Senegenin HPLC≥98% 0.156-10 ng/mL遠志皂苷元
CCL20/MIP-3alpha/MIP3A抗體,鼠單抗107316-88-1HPLC≥98%A065220mg/支ELISA 去澤拉木
ELISAKitforHumanFattyacid-bindingprotein,liver5302-45-4 20mg dencichine 0.156-10 ng/mL三七素
DCX抗體,兔多抗27208-80-6C20H22O8Polydatin≥98%ELISA 虎杖苷
人細胞角蛋白17(KRT-17)ELISA試劑盒25ML 0.156-10 ng/mL1,2-雙(2-氯乙氧基)乙烷 1,2-Bis(2-chloroethoxy)ethane >98.0%(GC)
平板計數瓊脂(含麥芽提取物)10mg 250gPeroxidase(HRP) 辣根過物酶 HRP
ELISAKitforHumanChondroitinsulfateproteoglycan4501-36-0 20mg Resveratrol 78-5000 pg/mL白藜蘆
氯化鈉蔗糖瓊脂/SodiumChlorideSucroseAgar76-66-4副溶血性弧菌的選擇性分離培養76-66-4 Rhynchophylline 鉤藤堿
人1型慢收縮性肌肌鈣蛋白I(TNNI1)ELISA試劑盒25mg 39-2500 pg/mL柯里拉京 CORILAGIN(P)
大鼠腎小球足細胞 20mg HPLC≥98%Onjisaponin B; Senegin III用于含量測定5 x 10^5 cells/T25培養瓶遠志皂苷B;遠志精Ⅲ
IL13/ALRH抗體,兔多抗1mgELISA 小豆蔻明 CARDAMONIN(RG)
ELISAKitforHumanAdiponectinreceptorprotein1 20mgGanoderic acid E HPLC≥98% 1.56-100 ng/mL靈芝酸E
N-Cadherin/CD325/CDH2抗體,兔多抗37271-16-2HPLC≥98%A018420mg/支ELISA 番瀉苷C
節狀古柏線蟲PCR檢測試劑盒供應商D-果糖/D-葡萄糖檢測試劑盒 K-FRUGL K-FRUGL 馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂
丁基苯酞;丁基酞內酯;3-正丁基苯酞 20mg n-Butylidenephthalide 轉基因植物NOS基因核酸檢測試劑盒 HPLC≥98%
基麥冬黃烷A 10mg Methylophiopogonanone A 人次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1(HPRT1)ELISA試劑盒
地榆皂苷I;地榆糖苷I HPLC≥98% Ziyuglycoside I 大鼠腹腔主動脈平滑肌細胞 用于含量測定
鼠尾草酸 HPLC≥98% A0003 CES3/Carboxylesterase3抗體,兔多抗,抗原親和純化 20mg/支
GLUTATHIONE SEPHAROSE 4FF 17-5132-01 Stuart運送培養基
劍葉龍血素A 20mg cochinchinenin A 人葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)ELISA試劑盒
重樓皂苷Ⅶ 20mg Polyphyllin VII 人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152)ELISA試劑盒