反應五要素:
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
產品名稱 | 鐮刀菌通用PCR檢測試劑盒供應商 |
英文名稱 | Fusarium spp.PCR |
分類 | PCR檢測試劑盒 |
特點:
高特異性:與其他病毒無交叉反應,無非特異性擴增;
高靈敏度:檢測靈敏度可達10~100;
操作簡便:該系列所有試劑均采用相同的體系和條件,可同時進行多個檢測;
高通量:多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。
樣品 DNA 的制備:
1.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀釋陽性對照(以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 片段作為陽性對照。
2.標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭,在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中,得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。8.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。?
使用及效果:
PCR反應特點
(1) 特異性強
PCR反應的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結合;
②堿基配對原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中zui小檢出率為3個細菌。
(3) 簡便、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2~4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4) 對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活PCR技術概論。
人胃平滑肌細胞,HGSMC細胞 20mg HPLC≥98%Theobromine用于含量測定5 x 10^5 cells/T25培養瓶可可堿
Interferonalpha-B/IFNA8抗體,兔多抗,抗原親和純化25MLELISA 乙二單丁基 Ethylene Glycol Monobutyl Ether >99.0%(GC)
人刺鼠色蛋白相關蛋白(AGRP)ELISA試劑盒78281-02-4 20mgHydroxysafflor yellow A HPLC≥98% 3.12-200 U/L羥基紅花黃色素A
ELISAKitforHumanAquaporin-217650-84-9 20mgKaempferol-3-O-rutinoside HPLC≥98% 0.78-50 ng/mL山-3-O-蕓香糖苷;莰菲-3-O-蕓香糖苷
ELISAKitforDeoxypyridinoline87701-68-6 20mg Alismoxide 0.312-20 ng/mL環氧澤瀉
NRG4抗體,兔多抗,抗原親和純化64809-67-2C25H28O16Neomangiferin≥98%ELISA 新芒果苷
人骨涎蛋白(BSP)ELISA試劑盒13241-28-610mg Chrysophanol 8-O-beta-D-glucoside 78-5000 pg/mL大黃-8-O-β-葡萄糖苷
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)5g 250gAdenosine 腺苷
ELISAKitforHumanMucin-1625mg 3.12-200 U/mL5-氨基乙酰丙酸 AMINOLEVULINIC ACID, 5-(RG)
葡萄糖ENZ-KIT149-0001 20支高靈敏度的胰島素原的檢測試劑盒
人原代NaiveTcell細胞 20mg HPLC≥98%Triptolide用于含量測定5 x 10^5 cells/T25培養瓶雷公藤素;雷公藤內酯;雷公藤多甙
人高轉移性肝癌細胞,MHCC-97H細胞 20mg HPLC≥98%Thiocolchicoside硫秋水仙苷 602-41-51 x 10^6 cells/T25培養瓶硫秋水仙苷;噻可撒可
LAMP-1/CD107a/LAMP1抗體(PE),鼠單抗1gFCM 肉桂酸芐酯 BENZYL CINNAMATE(P)
ELISAKitforHumanRadicalS-adenosylmethioninedomain-containingprotein210mg 0.78-50 ng/mL苯酰基-(2R,3S)-3-苯基異絲氨酸酯(紫杉側鏈) BENZYLOXYPHENYLISOSERINE METHYLESTER,N-(P)
ELF3抗體,兔多抗,抗原親和純化 629-78-7 1g 0.994WB IF ICC/IF 十七烷
人E3泛素蛋白連接酶CBL-B(E3ubiquitin-proteinligaseCBL-B)ELISA試劑盒 53947-92-5 20mg Corylin 7.8-500 ng/mL補骨脂寧
鐮刀菌通用PCR檢測試劑盒供應商亞硝?;呋瘎﹏or-AZADO 016-24923 葡萄球菌選擇性瓊脂/貝爾德-帕克瓊脂/StaphylococcusSelectiveAgar/BairdParkerAgar
擬人參皂苷RT5 20mg Pseudoginsenoside RT5 ELISAKitforHumanAzurocidin HPLC≥98%
香芹 CARVACROL(ISOTHYMOL)(P) 250mg Thioredoxin/TXN抗體,兔多抗
花生酸/二十烷酸 ARACHIDIC ACID(RG)(PLEASE CALL) 250mg ELISAKitforHumanSpondin-2
葒草苷 HPLC≥98% A0323 GBA3抗體(FITC),鼠單抗 20mg/支
Oxyteracycline HCL土霉素 10g Campy-Cefex添加劑
PVPP 聚乙聚咯烷銅 50g BIGGY瓊脂
基蓮心堿 20mg Neferine 人二氫葉酸還原酶(Dihydrofolatereductase)ELISA試劑盒