凋亡檢測操作流程
一、Annexin V 檢測凋亡細胞膜的改變
試劑及溶液：
A．對于單獨購買的試劑：
a) 10X Binding Buffer （貨號：556454）：0.1 M HEPES，pH 7.4；1.4 M NaCl；25 mM CaCl 2。使用前稀
釋至 1X。
b) Propidium Iodide（PI，貨號：556463）：建議與以下試劑同時使用 Annexin V-FITC（貨號： 556420,
556419）或 Annexin V-Biotin （貨號： 556418，556417）
c) Via-Probe™ （貨號：555816 ）：核酸染料 7-AAD。建議與以下試劑同時使用 Annexin V-PE（貨號：
556422，556421）或 Annexin V-Biotin（貨號：556418，556417）。
d) 1X PBS Buffer （貨號： 554781）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4 · 7H20, 0.24 g KH2PO4 , 加水至
1L。調整 pH 值至 7.2。 高壓滅菌室溫保存。
B．對于凋亡檢測試劑盒（貨號：556547）
a) FITC Annexin V （組分編號： 51-65874X）：每個樣本 5 μl 用量。
b) Propidium Iodide （PI，組分編號： 51-66211E)）：現成的核酸染料。每個樣本 5 μl 用量。
c) 10X Annexin V Binding Buffer（組分編號： 51-66121E）： 0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl,
25 mM CaCl2.使用時用雙蒸水配制成 1X。
操作步驟：
1．取 Falcon 試管，按標本順序編好陰性對照管和標本管號。
2．使用冷的 PBS 緩沖液洗細胞兩次，再用 1´ Binding Buffer 緩沖液制成 1´106 細胞/ml 的懸液。
3． Falcon 試管中加入 100 µl 細胞懸液。
4．按以下體積加入 Annexin V 與核酸染料：
管號 名稱 熒光標記 Annexin V 核酸染料：
1 陰性對照 - -
2 單陽 1 AV-FITC - 3 單陽 2 - PI
4 樣本 AV-FITC PI 5．輕輕混勻，室溫（20°C ~25°C）避光處放置 15 分鐘。
6． *使用 Annexin V-Biotin 試劑進行檢測時：
h 1´Binding Buffer緩沖液洗細胞一次，去上清。
h 1´Binding Buffer緩沖液100µl溶解SAv-FITC試劑0.5µg，加入到細胞管中。
h 輕輕混勻。加入5µl PI，室溫（20-25°C）避光處放置15分鐘。
7．各試驗管中分別加入 1´Binding Buffer 緩沖液 400µl。1 小時內上流式細胞儀測定結果。
Annexin V Blocking
待測細胞與未標記的重組 Annexin V 預孵育，然后進行實驗，是 Annexin V 細胞凋亡檢測的質量控制。
原理是預先阻斷 Annexin V-FITC 的結合位點，這樣可以證明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特異性。
1. 使用冷的PBS緩沖液洗細胞兩次，再用1´Binding Buffer緩沖液制成1´106細胞/ml的懸液。
2. 在5ml的培養管中加入100µl細胞懸液（約1´105個細胞）。
3. 加入5-15µg純化的重組Annexin V。注意，不同的細胞系，以及凋亡的不同階段，其Annexin V位點
飽和所需要的純化的重組Annexin V含量不同。某些情況下，為達到效果，可以減少細胞數量，
0.5´105個細胞加5-15µg純化的重組Annexin V。
4. 輕輕混勻，室溫反應15分鐘。
5. 加入5µl的Annexin V-FITC或/和PI，輕輕混勻，室溫避光處放置15分鐘。
6. 各試驗管中分別加入1´Binding Buffer緩沖液400µl。
7. 1小時內上流式細胞儀測定結果。 | 
