正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸輔酶 A 酯，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點(diǎn)。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理， 為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下測 4-香豆酸 CoA 生成速率，即可反映 4CL 活性。

粗酶液提?。?/span>

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔10s，重復(fù)30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標(biāo)儀 40℃預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 333nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 準(zhǔn)備 96 孔 UV 板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過可見光，不能透過紫外光，

檢測波長小于 340nm 務(wù)必使用 UV 板）。

3、 樣本測定

（1） 在試劑二中加入 10mL 試劑一充分溶解混勻，置于 40℃水浴預(yù)熱 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用

（ 配好后 24h 內(nèi)用完）；

（2） 在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑二，混勻，立即記錄 333nm 處初始吸光值 A1 和 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1。

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