層析技術--作為生物制藥行業(yè)常用的分離純化手段，廣泛應用于抗體、疫苗、基因與細胞治療、體外診斷等領域。其中，層析填料是層析技術的關鍵耗材。
根據(jù)前瞻產業(yè)研究院數(shù)據(jù)，2022 年全球層析填料市場規(guī)模預計達到 63 億美元，其中生物制藥是層析填料最為重要的應用領域[1]，隨著中國生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展，層析填料的需求與日俱增，而其作為分離純化的關鍵耗材，占據(jù)了下游生產大部分成本。各醫(yī)藥企業(yè)基于法規(guī)和成本的雙重考慮：在不影響產品質量及滿足產品收率的前提下，盡可能充分發(fā)揮填料的使用次數(shù)，延長填料的使用壽命，降低生產成本。
填料壽命研究開展的必要性
文獻研究表明：由于層析填料在其生命周期內一直循環(huán)暴露于各種生物作用環(huán)境下，填料會發(fā)生一系列老化反應，如圖1所示，包括配基問題(配基脫落、配基失活和配基閉塞)和柱床失效(基質污染、基質降解/變形)，進而影響到其純化效果[2]。
圖1(A)典型大規(guī)模生產使用protein A填料示意圖(B)層析柱和填料被暴露于各種生物作用環(huán)境下(C)重復循環(huán)使用后填料老化示意圖
因此，確定層析填料的使用壽命是一個非常重要的問題，各國監(jiān)管部門也出于對藥品安全性和有效性的考量，在其法規(guī)文件有明確規(guī)定：《中國藥典》三部的“人用重組單克隆抗體制品總論”中提到需要驗證純化用材料(如色譜柱填料)的重復使用性的可接受性限度[3]；FDA在1997年的“人用單克隆抗體產品的生產和分析考慮要點”中要求必須要有預先設定的使用限值[4]。
如何開展填料壽命驗證？
PDA TR14[5]，柱層析工藝的驗證中總結了層析填料所需要的研究/驗證及規(guī)模要求。有些驗證需要在商業(yè)化生產規(guī)模上進行，而有些則只能在縮小模型上進行(見表1)。
表1 不同規(guī)模的驗證研究
關于層析填料壽命驗證，大部分企業(yè)會在產品正式進入商業(yè)化生產之前，使用縮小模型開展填料的壽命研究，通過對柱效、載量、純度、雜質含量、收率等評判維度進行數(shù)據(jù)分析，以確定填料的循環(huán)使用壽命。
縮小模型采用線性縮小的原則，維持層析純化的柱床高度、線性流速、上樣載量、緩沖液/柱體積比值(CV數(shù))以及洗脫收集標準不變，縮小層析柱的柱直徑、體積流速和樣品體積，同時關注層析柱壓力、樣品擴散、系統(tǒng)死體積和柱效等因素。
層析填料壽命驗證評估維度
? 評估柱效(HETP、As)
? 動態(tài)結合載量
? 色譜圖(峰高、峰寬、峰收集體積)
? 產品回收率、純度
? 雜質殘留(DNA、HCP、Viruses、Endotoxin…)
良好的填料維護對層析填料的壽命至關重要，層析填料的維護主要包括再生、清潔和保存，需要同步開展驗證。
層析填料的清潔驗證
影響層析填料壽命的最重要因素是層析填料的再生和清潔。PDA TR14[5]指出：在進行驗證研究設計時就應考慮填料的再生方法，以便建立填料重復使用限度。在工藝研發(fā)階段，就應研發(fā)有效的填料清潔程序以允許介質在多次生產批的重復使用并且提供充分的清潔。填料清潔程序的有效性將通過縮小規(guī)模前瞻性研究建立，然后在生產規(guī)模條件下，通過一個驗證方案或者通過連續(xù)的監(jiān)測進行確認。填料的清潔程序應有效，以阻止殘留物的積累。這將最小化對后續(xù)批的殘留，保持填料的性能。
層析填料的清潔驗證可使用淋洗水方法或空白運行方法。檢測的項目則包括TOC、總蛋白以及一些特定工藝相關雜質，比如宿主細胞蛋白和宿主細胞核酸等。可接受標準的話，一般采用行業(yè)標準，不過企業(yè)也可以自行設定標準，尤其是對于特定的工藝相關雜質。
層析填料的保存驗證
PDA TR60-3[6]生物制藥原液的工藝驗證技術報告指出：應證明在預期壽命內保持層析填料性能特征所需要的保存時間和條件。盡管層析填料廠家可以提供填料的貨架期、保存液的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，但是仍然需要進行一定的層析填料保存驗證工作。主要是因為供應商提供的層析填料保存數(shù)據(jù)是使用新鮮填料，并且在散裝保存條件下進行。大多數(shù)生物制藥的實際生產中，保存的層析填料往往是使用過的，而且很多時候是柱上保存，因此層析填料的保存驗證應當考慮到這些實際條件，主要檢測項目包括微生物、內毒素、功能等。
案例分享--百林科抗體親和填料MaXtar ARPA壽命驗證
利用含有單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清，對MaXtar ARPA 親和層析介質進行了100個循環(huán)以上的測試，每個循環(huán)進行0.5 M NaOH 15 分鐘的在位清洗，測試數(shù)據(jù)表明MaXtar ARPA親和層析介質配基脫落水平較低，同時具有較高水平的動態(tài)結合載量(>70 mg/mL)，在進行100個循環(huán)試驗后依然可以達到80%初始水平。在146個試驗循環(huán)內，始終保持優(yōu)秀的HCP去除能力，同時樣品的SEC-HPLC表現(xiàn)出高純度和高穩(wěn)定性。
參考資料
1. 參考賽分招股書
2. Nweke MC, Rathore AS, Bracewell DG. Lifetime and Aging of Chromatography Resins during Biopharmaceutical Manufacture. Trend in Biotechnoly. 2018
3. US Food and Drug Administration (FDA). “Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use.” US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, February 1997
4. 2020 版《中國藥典》三部 “ 人用重組單克隆抗體制品總論 ”2.1.1工藝驗證
5. PDA Technical Report No.14 Validation of Column-Based Chromatography Processes for the Purification of Proteins
6. PDA Technical Report NO 60-3: Process Validation: A Lifecycle Approach Annex 2: Biopharmaceutical Drug Substances Manufacturing
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