聚合酶鏈式反應 (PCR) 是分子生物學領域功能強大的技術之一。實時熒光定量PCR 是在標準 PCR 技術基礎上演變而成，常用于定量樣本中的 DNA 或RNA。利用熒光探針或熒光 DNA 結合染料，采用實時熒光定量PCR 儀檢測熒光并完成 PCR 反應所需的熱循環，實現擴增產物的定量。實時熒光定量 PCR 分析的部分實施需要經過優化以確保所有反應參數均設置精確，從而獲得準確的結果。

1、引物和探針的儲存

盡管引物和探針的儲存經常被忽略，但其在保證實時熒光定量 PCR 分析的長期成功和一致性方面具有重要作用。影響引物和探針的穩定性的主要因素是儲存溫度、儲存時間、是否被長時間暴光、儲存的引物和探針的濃度以及儲存溶液的組分。圖3擴增曲線分別顯示了儲存不當的引物 (A) 與儲存適當的引物 (B) 產生的效果。

2、長期保持引物和探針的穩定性保持引物和探針的穩定性的關鍵有四點：

（1）低壓凍干的引物在儲存時間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解，即應置于 -20°C 保存，且若保存時間超過一年則應對其進行監測，看它是否出現功能下降。

（2）對于標記的引物和探針，則應采取措施避免標記物暴光 (例如使用不透明管及置于暗處保存)，以延長它們的使用壽命。

（3）引物濃度也可影響其穩定性。建議引物的儲存濃度不低于10 μM；實際上，在大多數情況下，100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應分裝保存，以減少凍融次數，特別是標記的引物和探針。

（4）最后，TE 緩沖液可形成比水更為穩定的環境。此外，含有 0.1 mM EDTA的 TE 緩沖液 (標準 TE 中含有 1 mM EDTA) 是一種理想的溶液，這是由于一些 PCR 反應對 EDTA 的靈敏度可能有一些殘存。