雙特異性抗體（Bispecific Antibody, BsAb）是一種通過基因重組技術創造的人工抗體，具備同時特異性地靶向并結合兩個不同抗原或抗原表位的能力。
憑借其特異性和雙功能性特點，BsAb類藥物已成為生物制藥研究領域的焦點，特別是在腫瘤治療、炎癥性疾病及自身免疫性疾病等多個醫療領域，展現出了極為廣闊的應用潛力和前景。
雙特異性抗體（BsAbs）的眾多下游工藝開發策略，很大程度上借鑒并擴展了單克隆抗體（mAbs）已經確立的純化方法。這一做法的合理性在于，BsAbs與mAbs之間確實存在著若干結構上的共通之處，使得mAbs的優化純化流程成為探索BsAbs純化工藝的理想起點。
Fig.1 免疫球蛋白G（IgG）單克隆抗體（mAb）以及主要的親和配體結合位點示意圖
Fig.1清晰地描繪了免疫球蛋白G（IgG）型單克隆抗體（mAb）的結構組成。該抗體由兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC）相互交織而成。
具體來說，重鏈（HC）包含了可變重鏈區（VH）、恒定區1（CH1）、鉸鏈區、恒定區2（CH2）以及恒定區3（CH3）等多個結構域；而輕鏈（LC）則包括可變輕鏈區（VL）和恒定輕鏈區（CL）。其中，VL與VH結構域配對形成抗體的可變片段（Fv），而VL、VH、CL與CH1結構域共同構成了抗原結合片段（Fab），這是抗體與抗原相互識別的關鍵區域。另一方面，CH2與CH3結構域則聯合組成了抗體的可結晶片段（Fc）區域。該區域負責抗體的效應功能，如與免疫細胞或補體系統的相互作用。
Fig.1還特別指出了IgG分子上主要的親和配體結合位點。這些位點以箭頭的形式標記，是設計純化策略時需要重點考慮的因素。通過對這些結構細節和結合位點的了解，研究人員能夠更有效地開發出針對BsAbs的純化工藝，從而實現高效、高純度的抗體生產。
根據BsAb的結構，主要可以將其分為三大類，即（i）非對稱型，（ii）對稱型和（iii）基于片段的BsAbs。它們的結構特性對它們的下游純化策略具有重要意義[1]。其分類主要基于Fig.2展示的三種主要形式：
（i）非對稱型雙抗：這種類型的雙抗通常具有衍生自兩種不同親本mAb的重鏈和輕鏈。其中輕鏈和/或重鏈的部分或全部也可以設計為在可能的情況下在兩個臂上相等，以盡量減少錯誤配對。
（ii）對稱型雙抗：對稱型雙抗同樣包含Fc片段，其兩側的結構域序列呈現對稱性，通過附加到抗體上的額外抗原識別結構域如scFv來實現多重特異性。
（iii）基于片段的雙抗：這類雙抗由可變區通過不同的連接方式構成，例如BiTE結構（一個scFv的VH與其自身的VL相連，同時也與另一個scFv的VL相連）和Diabody結構（兩個scFv不與其自身的VL和VH相連，而是分別與對方的VH和VL相連）。
Fig.2 雙特異性抗體的三種主要結構
雙特異性抗體的設計復雜性經常伴隨著多種副產物的產生，這些副產物極大地增加了后續純化步驟的挑戰性。以下是對幾種主要副產物及其形成原因的分析：
在細胞培養過程中，由于多種重鏈（HC）和輕鏈（LC）的共表達，雙抗容易發生HC和LC的錯配現象，導致大量具有相似大小和性質的非功能性或單特異性抗體的產生，也稱為同源二聚體。
為了減少錯配，可以通過分子設計來提高目標雙抗的形成概率。例如，廣泛應用的Knob-into-Hole（KiH）技術，但同源二聚化仍不能被消除。
缺失HC或LC的雙抗片段是常見的副產物，例如1/2 BsAb（缺少一條HC和一條LC）和3/4 BsAb（缺少一條LC）。
雙抗分子的結構比較復雜，形式多樣，而且分子結構特殊，易受到各種物理、化學和細胞生長壓力的影響而產生聚集體。
研究表明，基于片段的BsAb由于Fc區的缺失，比傳統的IgG更容易形成聚集體。對稱型BsAb也被觀察到具有較高的聚集體傾向（聚集體比例高達50%）。這種傾向可能部分由于鏈長度和靈活性的增加，導致分子間結構域更容易發生交換。
同源二聚體與雙抗分子的物理化學性質都十分的相似，因此需要結合目標雙抗分子與同源二聚體之間的結構、親和力、電荷性質及疏水性的差異來制定純化策略。
以下為親和、離子交換和復合模式層析方法對同源二聚體進行分離的具體案例。
Protein A可以特異性地結合IgG1或IgG4的Fc區域。通過改變重鏈與Protein A的結合能力，可以利用Protein A與同源二聚體之間的結合差異來去除同源二聚體。而不同輕鏈的設計可避免重鏈錯配，依據同源二聚體與完整抗體在Kappa輕鏈結構上的親和力差異，使用Protein L填料實現同源二聚體的有效分離。
利用目標雙抗與同源二聚體之間pI的差異，使用離子交換層析進行分離。文獻報道[2]的案例中通過質譜確認了目標BsAb的pI為7.24，同源二聚體的pI為8.04。使用Diamond Q（陰離子填料）類型填料，在選定的上樣、淋洗條件（pH7.5和電導率5mS/cm）和上樣載量（80mg/mL）下運行，帶正電荷的同源二聚體從層析填料上流穿，實現了與目標分子的良好分離。
MMC在離子相互作用的基礎上，另外具備了疏水、氫鍵和嗜硫作用，可利用同源二聚體與目標雙抗在疏水性以及表面電荷上的差異對其進行去除。
文獻報道[3]的案例中，使用Diamond MMC Mustang（陽離子復合填料）類型填料，在選定的上樣條件（即pH5.5和電導率5mS/cm）和上樣載量（30mg/mL）下運行，通過優化淋洗步驟，將淋洗條件優化為50mM His-HCl, 63mM NaCl, pH6.5，可以有效去除半抗和Knob-Knob同源二聚體。雖然Knob-Knob同二聚體結合比半抗體略強，但比靶BsAb弱得多，仍然可以在淋洗步驟被去除。
半抗體是雙抗分子組裝過程一種常見的副產物，是由于部分重鏈或輕鏈過表達，并且由于空間位阻等原因無法形成同源二聚體而產生的雜質。3/4抗體則主要是由于二硫鍵斷裂導致雙抗分子的一條輕鏈缺失所產生的雜質。
以下為通過親和、復合模式、離子交換層析方法對半抗、3/4抗等低分子量片段進行分離的具體案例。
半抗僅含一個Fc區，相較于含兩個Fc區域的目標抗體分子來說，半抗與親和填料結合能力弱，比目標分子更早洗脫，可通過pH線性梯度或等度pH洗脫去除。
MIX-A除了陰離子作用外，還具有疏水及氫鍵作用，可有效去除聚體、DNA、宿主蛋白、內毒素、Protein A等雜質。
在測試的對稱型雙抗案例中，使用Diamond MIX-A Mustang（陰離子復合填料），在選定的上樣條件（pH7.0）和上樣載量（30mg/mL）下運行，通過優化淋洗步驟，將淋洗條件優化為20mM PB, 0.3M Arg-Cl, pH7.0，可以有效地去除ScFv缺失的副產物，且不會淋洗出目的蛋白，洗脫產品SEC純度提高了8%。
利用目標雙抗與低分子量片段之間所帶電荷的差異，使用離子交換層析通過pH或者鹽梯度進行分離。
在測試的雙抗案例中，BsAb的pI為7.7，使用MegaPloy BXS（陽離子填料），在選定的上樣條件（pH6.0）和上樣載量（60mg/mL）下運行，洗脫步驟使用A: 20mM Citrate-Na, pH6.0和B: 20mM Citrate-Na, 0.3M NaCl, pH6.0, 進行0~10//0% B線性梯度洗脫。層析圖譜上發現低分子量的片段在洗脫峰尾出現了單獨的第二個較小的洗脫峰，通過SEC-HPLC和NR CE-SDS檢測，發現收集產品SEC提高了8.7%，CE-NR提高了10.5%，說明片段被明顯去除。
在測試的相同雙抗案例中，使用Diamond CD-S（陽離子填料），在選定的上樣條件（pH6.0）和上樣載量（60mg/mL）下運行，洗脫步驟使用A: 20mM Citrate-Na, pH6.0和B: 20mM Citrate-Na, 0.3M NaCl, pH6.0, 進行0~1//00% B線性梯度洗脫。層析圖譜上發現低分子量的片段在洗脫峰尾同樣出現了單獨的第二個較小的洗脫峰，通過SEC-HPLC和NR CE-SDS檢測，發現收集產品SEC提高了7.3%，CE-NR提高了11.0%，說明片段同樣能夠被Diamond CD-S有效去除。
在雙特異性抗體生產過程中，由于肽鏈的延伸提高了肽鏈的長度和靈活性，加劇了分子間的肽鏈纏繞，使得聚集體極易形成。此外，親和層析低pH洗脫條件也容易造成聚集體的形成。
以下為通過疏水和復合模式層析方法對高分子量聚集體進行分離的具體案例。
疏水層析在去除聚集體上效果突出。聚集體的疏水性比單體強，疏水層析可通過目標分子流穿模式去除聚集體。對于自身疏水性很強的目標分子可選用疏水性相對較弱的Octyl、Butyl填料篩選上樣條件，也可選用高分辨疏水填料進行洗脫分離聚體和目標抗體。
文獻報道[4]的案例中，目標產品為對稱型雙抗，首先使用Phenyl Bestarose HP（疏水填料）類型填料進行常規的遞減硫酸鈉梯度洗脫，以確定基線純度和回收率水平。在pH8下，使用遞減的硫酸鈉線性梯度（0.4~0M）進行洗脫，層析圖譜上發現洗脫峰分離效果不明顯，收集產品在SEC大于99%的純度下，收率僅為35.7%。通過優化后的洗脫條件，在使用遞減的硫酸鈉線性梯度（0.4~0M）上疊加遞增的精氨酸（0~1M）線性梯度，層析圖譜上洗脫峰出現明顯的拖尾，同時收集產品在SEC大于99%的純度下，收率為81.7%，提高了46%，說明聚集體與目標產品明顯分離。
Diamond MMC Mustang在雙抗的精純上應用非常廣泛，對降解片段、電荷異構體以及聚集體等副產品有較好的去除效果。
文獻報道[5]的案例中，目標產品為非對稱型雙抗，使用Diamond MMC Mustang（復合模式填料），在選定的上樣條件（硫酸銨濃度調節到1M，pH7.0）和載量（30mg/mL）下運行，洗脫步驟使用A: 50 mM Tris-HAc, 1 M (NH4)2SO4, pH7.0和B: 50 mM Tris-HAc, pH7.0, 進行0~1//00% B線性梯度洗脫。
通過Fig.3可以發現半抗以及高分子量雜質在洗脫峰尾富集，并且與目標雙抗明顯的分離。在這種情況下，主要是利用目標雙抗和高分子量聚集體之間疏水性差異實現分離。同時根據圖譜來看，Diamond MMC Mustang與某進口復合模式填料（MMC）在分離效果和產品質量上基本保持一致。
Fig.3 使用Diamond MMC Mustang和某進口復合模式層析柱在線性鹽梯度洗脫條件下的疊加層析圖譜
BsAb的復雜結構帶來了多種純化挑戰，但通過合理的設計和純化策略，可以有效提高目標BsAb的純度和產量。這些策略包括親和層析、離子交換層析、復合模式層析和疏水層析等，每種方法都有其特定的應用場景和優勢。
通過使用不同層析原理的填料進行有效組合，使得雜質在精純層析步驟中盡可能多的去除，最終得到穩健的下游工藝，使雙特異性抗體產品質量滿足放行要求。
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[1] Chen, Serene W, and W. Zhang. (2021)Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies. Antibody Therapeutics
[2] Chen, Wei, et al. (2023)Resin and loading condition screening for effective and robust byproducts removal by anion exchange chromatography: A case study. Protein expression and purification
[3] Tang, Jiaqin, et al. (2020)Removal of half antibody, hole-hole homodimer and aggregates during bispecific antibody purification using MMC ImpRes mixed-mode chromatography. Protein expression and purification
[4] Hall, Troii, G. M. Kelly, and W. R. Emery. (2018)Use of mobile phase additives for the elution of bispecific and monoclonal antibodies from Phenyl Sepharose HP and Capto Phenyl ImpRes Resins. Journal of Chromatography B
[5] Zhang, Shengwei, et al. (2021)Evaluating a new mixed-mode resin Diamond MMC Mustang using Capto MMC ImpRes as a benchmark. Protein Expression and Purification
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