β-受體激動(dòng)劑是一類(lèi)具有腎上腺素功能的苯乙醇胺類(lèi)人工合成化合物，具有舒張氣管平滑肌、減少肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒及介質(zhì)的釋放、降低微血管的通透性等作用。該類(lèi)藥物的使用劑量超過(guò)治療劑量的5~10倍時(shí)，能對(duì)牛、豬、羊、家禽等養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)的脂肪分解代謝增強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成增加，能顯著提高酮體的瘦肉率，改善養(yǎng)殖動(dòng)物日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，故被形象地稱(chēng)為“瘦肉精”。但高劑量的藥物使用容易導(dǎo)致在可食性動(dòng)物組織中的殘留，引起中毒現(xiàn)象。為了控制β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中非法濫用，確保動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全，中國(guó)、歐盟和日本等一些國(guó)家和地區(qū)都發(fā)布了一系列法規(guī)。
本文參考最新國(guó)標(biāo)GB 31658.22-2022標(biāo)準(zhǔn)，相比于以往標(biāo)準(zhǔn)的較大變化是更新了色譜柱，采用了五氟苯基柱替代常規(guī)的C18柱進(jìn)行分析，采用珀金埃爾默的QSight系列液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了快速高效的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法來(lái)準(zhǔn)確的分析動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑類(lèi)化合物的殘留量。
01 實(shí)驗(yàn)方法
樣品處理
參考標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.22-2022。
酶解與提取
稱(chēng)取試料2g(準(zhǔn)確至±0.05g)，于50mL離心管內(nèi)，加0.2mol/L 乙酸銨緩沖溶液6mL、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶40μL，渦旋混勻，37℃避光水浴震蕩16h，放置至室溫，備用。
萃取、凈化與濃縮
取備用液，加100ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液100μL，渦旋混勻，8000r/min離心8min，取上清液，加0.1mol/L高氯酸溶液5mL，渦旋混勻，用高氯酸調(diào)pH至1.0±0.2，8000r/min離心8min后，將上清液用10mol/L NaOH溶液調(diào)pH至10±0.5。加乙酸乙酯15mL，中速振蕩5min，5000r/min離心5min，取上層有機(jī)相。下層水相中再加入叔丁基甲醚10mL，中速振蕩5min，5000r/min離心5min，取上層有機(jī)相，合并，50℃下氮?dú)獯蹈?，?%甲酸溶液5mL溶解，備用。
取混合型陽(yáng)離子交換固相色譜柱，依次用甲醇、2%甲酸溶液各3mL活化，取備用液過(guò)柱，依次用2%甲酸溶液、甲醇各3mL淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3mL洗脫，洗脫液在50℃下氮?dú)獯蹈伞?br />
殘余物中加入甲醇-0.1%甲酸溶液(10+90，V/V)0.5mL，充分溶解，過(guò)0.22μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。
02 儀器方法
珀金埃爾默LX50 UHPLC參數(shù)
色譜柱：Kinetex 2.6μm F5 50*3.0mm
柱溫：40℃
流速：0.4mL/min
進(jìn)樣量：5μL
表1.液相色譜梯度洗脫表
珀金埃爾默QSight 220™質(zhì)譜參數(shù)
目標(biāo)化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)下表2和表3。
表2.質(zhì)譜離子源參數(shù)
表3.化合物質(zhì)譜參數(shù)(點(diǎn)擊查看大圖)
03 結(jié)果譜圖及結(jié)論
標(biāo)準(zhǔn)曲線
用甲醇-0.1%甲酸溶液(10+90，V/V)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml和50ng/ml，含混合內(nèi)標(biāo)5ng/ml，擬合后的標(biāo)曲如下圖，R2均在0.994以上，線性較好。
圖1.18種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線情況(點(diǎn)擊查看大圖)
圖2考察了進(jìn)樣濃度為2ng/ml時(shí)，18種β-受體激動(dòng)劑類(lèi)化合物的提取離子譜圖情況。
圖2.18種β-受體激動(dòng)劑的EIC提取譜圖(1ng/ml，2μL)(點(diǎn)擊查看大圖)
結(jié)論 Summary
本文采用LX50-QSight 220三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，在電噴霧電離模式下，對(duì)動(dòng)物性食品中的β-受體激動(dòng)劑類(lèi)化合物進(jìn)行了方法的開(kāi)發(fā)與測(cè)試，通過(guò)以上結(jié)果可見(jiàn)，該儀器具有優(yōu)異的靈敏度，檢出限完全滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求，可以輕松應(yīng)對(duì)日常檢測(cè)的需求，該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中建議使用的五氟苯基柱相比于C18柱，無(wú)論是在保留還是峰形、以及溶劑效應(yīng)影響方面，都有較大改善。
珀金埃爾默的QSight系列三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)具有HSID熱表面誘導(dǎo)去溶劑的專(zhuān)利技術(shù)，使其具有優(yōu)異的自清潔功能，應(yīng)對(duì)該類(lèi)復(fù)雜基質(zhì)樣品分析時(shí)，可以起到抗污染免維護(hù)的作用，大大節(jié)省了儀器的維護(hù)成本和人員工作效率的提升。
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